The object of research, development or design (in Russian) : Фермент CRISPR/Cas систем Cas12a

The object of research, development or design (in Kazakh) : CRISPR/Cas жүйесі Cas12a ферменті

Aim of work (in Russian) : Биохимическая характеристика ферментов Cas12a системы CRISPR/Cas

Aim of work (in Kazakh) : CRISPR/Cas жүйесінің Cas12a ферменттерінің биохимиялық сипаттамасы

Методы исследования (на русском) : Методы молекулярной биологии и генетической инженерии: полимеразная цепная реакция, клонирование генов при помощи ферментов нуклеинового обмена, трансформация бактерий методом температурного шока и электропорационного переноса плазмидной ДНК. Методы ионообменной хроматографии на анионно- и катионно-обменных сорбентах и метало-хелатной (аффинной) хроматографии на ионах никеля Ni2+. Определение нуклеотидной последовательности (сиквенс) по методу Сенгера.

Методы исследования (на казахском) : Молекулярлық биология және гендік инженерия әдістері: полимеразды тізбекті реакция, нуклеин қышқылының метаболизмі ферменттерінің көмегімен гендерді клондау, температуралық соққы арқылы бактерияларды трансформациялау және плазмидті ДНҚ-ның электропорациялық тасымалдануы. Аниондық және катионалмастырғыш сорбенттердегі ионалмастырғыш хроматография және никель иондары Ni2+ метал-хелатты (тұғындылық) хроматографиясының әдістері. Сэнгер әдісімен нуклеотидтер тізбегін (тізбегін) анықтау.

Obtained results and novelty (in Russian) : 3. crРНК синтезировали с помощью Т7 РНК-полимеразы с последующей обработкой ДНКазой I. Последовательности ДНК (68-меры), содержащие промотор Т7, синтезировали и отжигали с образованием матриц двухцепочечной ДНК для транскрипции in vitro. Последовательности, соответствующие как PAM, так и не-PAM участкам, были клонированы в вектор pGEM-T и лигированы лигазой T4. Анализы коллатеральной активности транс-расщепления Cas12a на основе флуоресценции, проводили в следующих условиях: 100 нМ Cas12a, 100нМ крРНК, 2,5 мкМ флуоресцентной репортерной молекулы (5’FAM-TTATT-3’). В результате было определено, что при инкубации рибонуклеопроинового комплекса crРНК-Cas12a с целевой последовательностью различных субстратов, содержащих PAM-участок 5’-TTTA-3’, происходило расщепление дцДНК в заданном положении. Таким образом, в качестве последовательности PAM-участка для ферментов Cas12a Moraxella bovis и Moraxella equi были определены субстраты, содержащие PAM-участок 5’-TTTN-3’. 4. Оптимизированы условия биохимической реакции (температура и время реакции, концентрация компонентов реакции, состав реакционного буфера). Определена активность эндонуклеазы Cas12a относительно различных субстратов. Получены флуоресцентно-меченые олигонуклеотиды. Скрининг условий выполняли с использованием коммерческих растворов из наборов Index HT, PEG/Ion HT компании Hampton Research и ProPlex компании Molecular Dimensions в 96-луночных планшетах методом диффузии в паре «висячей капли» для кристаллизации.

Obtained results and novelty (in Kazakh) : 3. crPHK Т7 РНҚ полимеразасы арқылы синтезделді, содан кейін құрамында T7 промоторы бар ДНҚ тізбегі (68-мерлер) in vitro транскрипция үшін қос тізбекті ДНҚ үлгілерін жасау үшін синтезделді және күйдірілді. PAM және PAM емес бөлімдерге сәйкес келетін тізбектер pGEM-T векторына клондалған және T4 лигазасымен байланған. Флуоресценция негізінде cas12a транс-бөлінуінің коллатеральды белсенділігін талдау келесі жағдайларда жүргізілді: 100нм Cas12a, 100нМ крРНҚ, 2,5 мкМ флуоресцентті репортер молекуласы (5'FAM-TTATT-3'). Нәтижесінде 5'-TTTA-3' PAM учаскесі бар әртүрлі субстраттардың мақсатты тізбегі бар crРНҚ-Cas12a рибонуклеопроиндік кешенін инкубациялау кезінде етДНҚ берілген позицияда ыдырағаны анықталды. Осылайша, Сas12a Moraxella bovis және Moraxella equi ферменттері үшін PAM учаскесінің тізбегі ретінде 5'-TTTN-3' PAM учаскесі бар субстраттар анықталды. 4. Биохимиялық реакция шарттары оңтайландырылған (реакция температурасы мен уақыты, реакция компоненттерінің концентрациясы, реакция буферінің құрамы). Скрининг шарттары Hampton Research компаниясының Index HT, PEG/Ion HT және Molecular Dimensions компаниясының ProPlex жиынтықтарынан кристалдану үшін "ілулі тамшы" жұбында диффузия әдісімен 96 шұңқырлы планшеттердегі коммерциялық ерітінділерді қолдану арқылы орындалды.

The main constructive and technical economic indicators (in Russian) : -

The main constructive and technical economic indicators (in Kazakh) : -

Level of implementation (in Russian) : -

Level of implementation (in Kazakh) : -

Efficiency (in Russian) : -

Efficiency (in Kazakh) : -

Field of application (in Russian) : Фундаментальные исследования

Field of application (in Kazakh) : Негізгі зерттеулер