The object of research, development or design (in Russian) : Фермент репарации ДНК Nfo

The object of research, development or design (in Kazakh) : ДНҚ репарациясы фермент Nfo

Aim of work (in Russian) : Структурно-функциональное исследование ферментов репарации ДНК у Staphylococcus aureus

Aim of work (in Kazakh) : Staphylococcus aureus-дағы ДНҚ репарациясы ферменттерін құрылымдық және функционалдық зерттеу

Методы исследования (на русском) : Методы молекулярной биологии и генетической инженерии: полимеразная цепная реакция, клонирование генов при помощи ферментов нуклеинового обмена, трансформация бактерий методом температурного шока и электропорационного переноса плазмидной ДНК. Методы ионообменной хроматографии на анионно- и катионно-обменных сорбентах и метало-хелатной (аффинной) хроматографии на ионах никеля Ni2+. Определение нуклеотидной последовательности (сиквенс) по методу Сенгера. Структурный анализ путем кристаллизации фермента.

Методы исследования (на казахском) : Молекулярлық биология және гендік инженерия әдістері: полимеразды тізбекті реакция, нуклеин қышқылының метаболизмі ферменттерінің көмегімен гендерді клондау, температуралық соққы арқылы бактерияларды трансформациялау және плазмидті ДНҚ-ның электропорациялық тасымалдануы. Аниондық және катионалмастырғыш сорбенттердегі ионалмастырғыш хроматография және никель иондары Ni2+ метал-хелатты (тұғындылық) хроматографиясының әдістері. Сэнгер әдісімен нуклеотидтер тізбегін (тізбегін) анықтау. Ферменттің кристалдануы арқылы құрылымдық талдау.

Obtained results and novelty (in Russian) : Получены гены ферментов репарации Nfo и DnaN. Гены были клонированы в экспрессионные вектора pET28c и pET11a по сайтам рестрикции NdeI и BamHI под контроль Т7-промотора, который обеспечивает высокую экспрессию целевых генов. С помощью методов секвенирования экспериментально подтверждено отсутствие мутаций в виде делеций, вставок и замен. Полученным вектором pET11a/SaNfo были трансформированны мутантные по АП-эндонуклеазам (xthA-, nfo-) клетки Е. coli BH110(DE3), вектором pET28c/SaDnaN - клетки различных штаммов Е. coli ArcticExpress (DE3)RP, BL-21 (DE3) и Rosetta 2 (DE3) для проверки индукции. Рекомбинантные белки очищены с помощью аффинной хроматографии на колонках с иммоблизированным гепарином и никель-сефарозой. После экспрессии и очистки из E. coli была охарактеризована ДНК- субстратная специфичность фермента Nfo. Добавление двухвалентных катионов в значительной степени стимулирует активность репарации ДНК, указывая на то, что Nfo является металл-зависимым ферментом. АП эндонуклеазная активность была стимулирована в присутствии ионов Mn2+, Mg2+, Ca2+. Зависимость от температуры, рН и ионной силы. Nfo-катализируемая активность расщепления АП сайта имеет оптимум в диапазоне рН 8,0-8,5, при высокой ионной силе 300 мМ КСl и +37°С Время кристаллизации составляло 7-14 дней. Появившиеся кристаллы исследовали с помощью оптического микроскопа Olympus SZX16.

Obtained results and novelty (in Kazakh) : Nfo және DnaN репарация ферменттерінің гендері алынды. Гендер pET28c(+) және pET11a экспрессиялық векторға NdeI және BamHI рестрикция сайттарымен негізгі генның жоғарғы деңгейдегі экспрессиясын қамтамасыз ететін Т7-промотор негізінде клондалды. Секвенс тәсілдері арқылы тәжірибе жүзінде делеция, қосынды және орын ауысу мутацияларының жоқтығы дәлелденді. Алынған pET11a/SaNfo векторлары АП-эндонуклеаза Е.coli мутанттары (xthA-, nfo-) және pET28c/SaDnaN компетентті әртүрлі штаммдары ArcticExpress (DE3)RP, BL-21 (DE3) және Rosetta 2 (DE3) индукциясын тексеру үшін трансформацияланды. Рекомбинантты ақуыздар иммобилизацияланған гепарин мен никель-сефарозадан тұратын колонкада аффиндік хроматография көмегімен тазартылды. E.coli-дан экспрессия мен тазалаудан кейін Nfo ферментінің ДНҚ-субсратты ерекшеліктері сипатталды. Еківалентті катиондар ДНҚ репарация белсенділігін арттырады Nfo метал-тәуелді фермент екенін негіздейді. Mn2+, Mg2+, Ca2+ иондарын қосқан кезде АП эндонуклеазалық белсенділігін арттырады. рН 8,0-8,5, 300 mM KCl жоғар иондық күште және +37 градуста Nfo катализаторлық АП-сайт ыдырату белсенділігі байқалды. Кристаллицазиялау уақыты 7-14 күн. Пайда болған кристалдар Olympus SZX16 оптикалық микроскопта зерттелді. Кристалдардың пайда болуы және өсуі үшін ең ықтимал жағдайлар алу үшін келесі буферлер қолданылды: 2М аммоний сульфаты, 0.1М BisTris pH 5.5, 25% PEG 3,350 және 2 M аммоний сульфаты, 0.1 М Hepes pH7.

The main constructive and technical economic indicators (in Russian) : -

The main constructive and technical economic indicators (in Kazakh) : -

Level of implementation (in Russian) :

Level of implementation (in Kazakh) :

Efficiency (in Russian) :

Efficiency (in Kazakh) :

Field of application (in Russian) : Фундаментальные исследования

Field of application (in Kazakh) : Негізгі зерттеулер