The object of research, development or design (in Russian) : Фермент CRISPR/Cas систем Cas12a

The object of research, development or design (in Kazakh) : CRISPR/Cas жүйесі Cas12a ферменті

Aim of work (in Russian) : Биохимическая характеристика ферментов Cas12a системы CRISPR/Cas

Aim of work (in Kazakh) : CRISPR/Cas жүйесінің Cas12a ферменттерінің биохимиялық сипаттамасы

Методы исследования (на русском) : Методы молекулярной биологии и генетической инженерии: полимеразная цепная реакция, клонирование генов при помощи ферментов нуклеинового обмена, трансформация бактерий методом температурного шока и электропорационного переноса плазмидной ДНК. Методы ионообменной хроматографии на анионно- и катионно-обменных сорбентах и метало-хелатной (аффинной) хроматографии на ионах никеля Ni2+. Определение нуклеотидной последовательности (сиквенс) по методу Сенгера.

Методы исследования (на казахском) : Молекулярлық биология және гендік инженерия әдістері: полимеразды тізбекті реакция, нуклеин қышқылының метаболизмі ферменттерінің көмегімен гендерді клондау, температуралық соққы арқылы бактерияларды трансформациялау және плазмидті ДНҚ-ның электропорациялық тасымалдануы. Аниондық және катионалмастырғыш сорбенттердегі ионалмастырғыш хроматография және никель иондары Ni2+ метал-хелатты (тұғындылық) хроматографиясының әдістері. Сэнгер әдісімен нуклеотидтер тізбегін (тізбегін) анықтау.

Obtained results and novelty (in Russian) : Протяженность гена Cas12a из Moraxella bovis составила 3789 п.о., у Moraxella equi – 3753 п.о. Гены были клонированы в экспрессионный вектор pET28c(+) по сайтам рестрикции NdeI и BamHI под контроль Т7-промотора, который обеспечивает высокую экспрессию целевого гена. Секвенирование клонов подтвердило отсутствие мутаций в рамке считывания, в результате были получены экспрессионные вектора pET28c/Mbovis/Cas12a и pET28c/Mequi/Cas12a. Полученными векторами pET28c/Mbobis/Cas12a и pET28c/Mequi/Cas12a были трансформированны компетентные клетки различных штаммов Е.coli ArcticExpress (DE3), BL-21 (DE3) и Rosetta 2 (DE3) для проверки индукции. Все трансформированные штаммы показали способность продуцировать рекомбинантные белки Cas12a. Для экспрессии и наработки рекомбинантного белка Cas12a из обоих штаммов Moraxella был выбран штамм Rosetta 2 (DE3). В дизайне направляющих (гидовых) РНК, были учтены последовательность и структурные требования гидовой РНК для образования рибонуклеопротеинового комплекса и последующего расщепления ДНК с помощью фермента Cas12a. Для синтеза гидовых РНК были использованы дуплексные олигонуклеотиды, содержащие промоторную область Т7 для Т7 РНК полимеразы. Фермент Cas12a вместе с гидовой РНК, нацеленной на мишень, был способен эффективно расщеплять целевую последовательность.

Obtained results and novelty (in Kazakh) : Moraxella bovis-тан алынған Cas12a генінің ұзындығы 3789 негізден, ал Moraxella equi 3753 негіздіен тұрады. Гендер арнайы эксперсивті pET28c(+) векторына NdeI және BamHI рестрикция жақтары арқылы Т7-промотерының бақылауымен клондалды, бұл барлық геннің жоғары деңгейдегі экспрессиясын қамтамасыз етті. Клондарды секвенстеу барысында мутацияның жоқтығын дәлелдеді, нәтижесінде pET28c/Mbovis/Cas12a және pET28c/Mequi/Cas12a эксперсивті вектордар алынды. pET28c/Mbobis/Cas12a және pET28c/Mequi/Cas12 векторлары арқылы Е.coli ArcticExpress (DE3), BL-21 (DE3) және Rosetta 2 (DE3) секілді трансформацияға төзімді әртүрлі жасушалардың штаммдары индукция өткізу үшін алынды. Барлық трансормацияланған штаммдар рекомбинанты Cas12a нәруызын өндіретіндігі көрсетті. Rosetta 2 (DE3) Moraxella екі түрлі штаммдарының арасынан рекомбинатты Cas12a нәруызын эксперсивтеу және жинақтау үшін таңдалынды. Гидовый PНҚ дизайынын жасағанда гидовый РНҚ реттілігі және құрылымы рибонуклеотидті комплекс құруы және алдағы ДНҚ-ның Cas 12a ферменті көмегімен ыдырауы үшін сақталынды. Гидовый РНҚ дизайны кезінде бағыттаушы тізбектің ұзындығына қойылатын талаптар ескерілді, Cas12a үшін бағыттаушы 16 нуклеотид тізбегінен кем емес нысан тізбегі in vitro ДНҚ ыдырауы үшін таңдалды. Бағыттаушы РНҚ синтезі үшін T7 РНҚ полимеразасының T7 промотор аймағы бар олигонуклеотидтер дуплексі пайдаланылды. In vitro мақсатты ДНҚ-ның ыдырауы үшін бағыттаушы РНҚ-мен реакциялар орнатылды.

The main constructive and technical economic indicators (in Russian) : -

The main constructive and technical economic indicators (in Kazakh) : -

Level of implementation (in Russian) :

Level of implementation (in Kazakh) :

Efficiency (in Russian) :

Efficiency (in Kazakh) :

Field of application (in Russian) : Фундаментальные исследования

Field of application (in Kazakh) : Негізгі зерттеулер