The object of research, development or design (in Russian) : Мокрота, бактериальные возбудители пневмонии у человека, геномная ДНК

The object of research, development or design (in Kazakh) : Қақырық, адамдардағы пневмонияның бактериялық қоздырғыштары, геномдық ДНҚ

Aim of work (in Russian) : Целью проекта является изучение изменчивости микробного состава и устойчивости к противомикробным препаратам у пациентов с бактериальной пневмонией на фоне приема антибиотиков, с использованием классического метода определения чувствительности к противомикробным препаратам и таргетного NGS секвенирования

Aim of work (in Kazakh) : Жобаның мақсаты антибиотиктерді қабылдау кезіндегі бактериялық пневмониямен ауыратын науқастарда микробтық құрамның өзгергіштігін және микробқа қарсы тұрақтылықты классикалық әдіспен және таргеттік NGS секвенирлеуді қолдана отырып, микробқа қарсы препараттарға сезімталдықты зерттеу болып табылады

Методы исследования (на русском) : На первом этапе подготовки библиотеки в планшеты вносили по 10 мкл мастер-микса и добавляли ДНК 1 мкл, затем переносили 5 мкл во второй ряд. В первый ряд добавляли по 5 мкл праймер пул 1. Во второй ряд по 5 мкл праймер пул 2. Наработку проводили в режиме: 99 С – 2 мин, 99 С – 15 сек -15 циклов, 60 С – 8 мин. Ампликоны объединяли путем переноса 10 мкл из второго ряда в первый. Для расщепления ампликонов к каждому образцу добавляли по 2 мкл FuPa Reagent. Тщательно перемешивали и нарабатывали при: 50 С – 10 мин, 55 С – 10 мин, 60 С – 20 мин. Для лигирования адаптеров к ампликонам добавляли Switch Solution – 4 мкл, IonCode adapter – 2 мкл и DNA Ligase – мкл, с последующим 22 C – 30 мин, 68 C – 5 мин, 72 C – 5 мин. Для очистки добавляли 45 мкл AMPure XP, смешивали и инкубировали при комнатной температуре 5 мин. Добавляли 50 мкл буфера супернатант переносили в 0,2 мл ПЦР пробирки. NGS еквенирование проводили с использованием панели Ion AmpliSeqTM Pan-Bacterial Research panel. Для анализа данных секвенирования использовали плагин Torrent Suite. Полученный на чипе массив последовательностей подвергался этапам фильтрации, где из общего количества полученных ридов убирались данные пустых ячеек, поликлональные последовательности, риды с низким качеством, а также димеры адаптеров. Последовательности ДНК по каждой пробе в итоге суммированы в отдельном FASTAQ файле. За отчетный период для секвенирования 180 проб ДНК мокроты (и отдельных повторностей) были использованы три типа 140 chip.

Методы исследования (на казахском) : Кітапхананы дайындаудың алғашқы кезеңінде планшет ұяшықтарына 10 мкл мастер-микс енгізіліп, оған 1 мкл ДНҚ қосылды. Кейін қоспадан 5 мкл көлемінде екінші қатардағы ұяшықтарға ауыстырылды. Амплификация келесі температуралық режимде жүргізілді: 99°C – 2 мин; 15 цикл: 99°C – 15 с және 60°C – 8 мин. Ампликондарды ыдырату үшін әр сынамаға 2 мкл FuPa реагенті қосылып, мұқият араластырылды және инкубациялық бағдарламада жүргізілді. Ампликондарға адаптерлерді лигирлеу үшін 4 мкл Switch Solution, 2 мкл IonCode adapter және 1 мкл DNA Ligase қосылады. Кітапхананы тазарту үшін әр сынамаға 45 мкл AMPure XP реагенті қосылып, пипеткамен араластырылды және бөлме температурасында 5 минут инкубацияланды. NGS секвенирлеу Ion AmpliSeq Pan-Bacterial Research Panel панелі көмегімен жүргізілді. Алынған секвенирлеу деректерін талдау үшін Torrent Suite плагині пайдаланылды. Чипте алынған тізбектер жиыны сүзгіден өткізу сатыларынан өтті, онда жалпы ридтер санынан бос ұяшықтардың деректері, поликлоналды тізбектер, төмен сапалы ридтер, сондай-ақ адаптер димерлері алынып тасталды. Әр сынама бойынша алынған ДНҚ тізбектері кейін жеке-жеке FASTAQ форматында сақталды. Есептік кезеңде қақырық ДНҚ-сының 180 сынамасы (соның ішінде кейбір қайталама үлгілер) секвенирленді.

Obtained results and novelty (in Russian) : После подготовки библиотек проводили подсчет концентрации. Концентрации ДНК точки 1 были различными, среднее значение в пределах 154 нг/мкл. У 18 проб были низкие концентрации, для них проведены повторные работы. Для точки 2 среднее значение составила 212 нг/мкл. 19 проб были повторно реамплифицированы. Разведение библиотек доводили до 100 pM, затем объединяли в одну пробирку в равных объемах. Данные секвенирования показали загруженность чипа 1 на 92%.. Фильтрация сырых данных показало на наличие 26% поликлоналов, 9,5% ридов с низким качеством и 11,5 димеров адаптеров. После оценки качества ≥ Q20 осталось 6 684 624 151 оснований. Общее количество ридов составило 67 538 123. Загруженность чипа 2 составило 91%. Обнаружено 9% пустых ячеек, 25,4% поликлональных, 11% ридов с низким качеством и 12% адаптеры димеров. После ≥ Q20 составило 6 475 787 467 оснований. Чип 3 - 93% (9,84 G). Обнаружено 7% пустых ячеек, 27,5% поликлональных, 52% ридов с низким качеством и 5,1% адаптеры димеров. На выходе мы получили 87,4 млн. ридов. После ≥ Q20 значение составило 8 606 275 152 оснований. Данные секвенирования точки 1 показывают 10 213 964 рида, по 16S rRNA 66 439 744 рида. По точке 2 картитированы по ID, AMR составляют 10 930 098 ридов, по 16S rRNA 66 829 854 рида. Секвенированные последовательности ДНК хранятся в FASTAQ в памяти рабочей станции для проведения дальнейшего биоинформатического анализа.

Obtained results and novelty (in Kazakh) : Кітапхана дайындағаннан кейін концентрациялар есептелді. 1-ші нүкте үшін ДНҚ концентрациясы өзгеріп отырды, орташа мәні 154 нг/мкл шегінде болды. Он сегіз үлгінің концентрациясы төмен болды және қайта күшейтілді. 2-ші нүкте үшін орташа мән 212 нг/мкл болды. Он тоғыз үлгі қайта күшейтілді. Кітапханалар 100 пМ дейін сұйылтылып, содан кейін бір түтікке тең көлемде біріктірілді. Реттік деректер 1-чиптің 92% пайдаланылғанын көрсетті. Шикі деректерді сүзу 26% поликлоналды, 9,5% төмен сапалы оқуларды және 11,5 адаптер димерлерін анықтады. Сапаны бағалау ≥ Q20-дан кейін 6 684 624 151 негіз қалды. Оқудың жалпы саны 67 538 123 болды. 2-чиптің пайдаланылуы 91% болды. 9% бос жәшіктер, 25,4% поликлоналды, 11% төмен сапалы оқуларды және 12% димер адаптерлері анықталды. ≥ Q20-дан кейін жалпы оқу саны 6 475 787 467 негізді құрады. 3-чип - 93% (9,84 Г). 7% бос жәшіктер, 27,5% поликлоналды, 52% төмен сапалы оқулар және 5,1% димер адаптерлері анықталды. Шығыста біз 87,4 миллион оқу алдық. ≥ Q20-дан кейін мән 8 606 275 152 негізді құрады. 1-тармақ үшін секвенирлеу деректері 10 213 964 оқуды, 16S рРНҚ үшін 66 439 744 оқуды көрсетеді. 2-тармақта AMR идентификаторы арқылы картаға түсірілді, ол 10 930 098 оқуды және 16S рРНҚ үшін 66 829 854 оқуды қамтиды. Реттік ДНҚ тізбектері биоинформатикалық талдауды одан әрі жүргізу үшін жұмыс станциясының жадындағы FASTAQ жүйесінде сақталады.

The main constructive and technical economic indicators (in Russian) : В работе используются новые подходы секвенирования следующего поколения NGS. Возможности таргетного NGS секвенирования позволят провести анализ образцов мокроты больных пациентов, принимавших антибиотики в определенные периоды времени по 364 генам устойчивости. В результате будут получены данные по изменению микробиологического состава и возможного появления новых устойчивых к антибиотикам у принимавших антимикробные препараты.

The main constructive and technical economic indicators (in Kazakh) : Зерттеуде жаңа келесі буын секвенирлеу тәсілдері қолданылады. Нысаналы NGS секвенирлеу мүмкіндіктері белгілі бір уақыт аралығында антибиотиктер қабылдаған пациенттерден алынған қақырық үлгілерін талдауға мүмкіндік береді, бұл 364 төзімділік генін нысанаға алады. Бұл микробиологиялық құрамның өзгеруі және антибиотиктер қабылдайтындарда жаңа антибиотиктерге төзімді бактериялардың пайда болуы туралы деректер береді.

Level of implementation (in Russian) :

Level of implementation (in Kazakh) :

Efficiency (in Russian) : Обнаружение генов УПП и появление новых устойчивых микроорганизмов позволит дать оценку лечения и возможно рекомендации по выбору эффективного лекарства.

Efficiency (in Kazakh) : AMR гендерінің ашылуы және жаңа төзімді микроорганизмдердің пайда болуы емдеуді бағалауға және тиімді препаратты таңдау бойынша ұсыныстар жасауға мүмкіндік береді.

Field of application (in Russian) : Полученные результаты могут лечь в основу в мероприятиях, направленных на борьбу с распространением УПП в Казахстане. Внедрение передовых технологий NGS секвенирования в научные организации и привлечение в исследования молодых ученых позволят повысить научный потенциал и методологическую платформу научных изысканий в Республике Казахстан.

Field of application (in Kazakh) : Алынған нәтижелер Қазақстанда AMR таралуына қарсы күресуге бағытталған шаралардың негізі бола алады. Ғылыми ұйымдарға озық NGS секвенирлеу технологияларын енгізу және жас ғалымдарды зерттеулерге тарту Қазақстан Республикасындағы ғылыми әлеуетті және ғылыми зерттеулердің әдіснамалық платформасын арттырады.