The object of research, development or design (in Russian) : Объектами исследования являются ферменты репарации ДНК NucS и DnaN Mycobacterium tuberculosis.

The object of research, development or design (in Kazakh) : Зерттеу нысандары – Mycobacterium tuberculosis бактериясының ДНҚ репарация ферменттері NucS және DnaN.

Aim of work (in Russian) : Цель проекта - исследование структуры и функций ранее не охарактеризованного фермента MtbNucS.

Aim of work (in Kazakh) : Жобаның мақсаты – бұрын сипатталмаған MtbNucS ферментінің құрылымы мен функцияларын зерттеу.

Методы исследования (на русском) : Методы проведения работы - методы молекулярной биологии и биохимии.

Методы исследования (на казахском) : Зерттеу жүргізу әдістері – молекулалық биология және биохимия әдістері.

Obtained results and novelty (in Russian) : Получены вектора pET28c(+)/NucS, pMBP-parallel2/NucS и pET28c(+)/MtbDnaN. Был очищен рекомбинантный белок NucS, экспрессированный культурами E. coli Arctic Express (DE3)/ pET28c(+)/MtbNucS и Arctic Express (DE3)/ pMBP-parallel2/MtbNucS. После экспрессии гибридного белка MBP-NucS в культуре E. coli Arctic Express (DE3)/ pMBP-parallel2/NucS был проведён гидролиз гибридного белка с использованием TEV-протеазы. После удаления остатков нерасщеплённого белка и протеазы методом гель-фильтрации, полученные фракции содержали преимущественно целевой белок высокой степени гомогенности. Был получен рекомбинантный белок MtbDnaN после очистки из культуры E. coli Arctic Express (DE3)/ pET28c(+). Белок MtbNucS проявляет нуклеазную активность в отношении ДНК-субстратов, содержащих ошибочно спаренные основания GT и UG. Оптимальные условия для каталитической активности: 25 мМ Tris-HCl pH 8,0; 5 мМ DTT; 0,1 мг/мл BSA; 0,1% Triton X-100, 40 мМ MgCl₂ и 2,25 мМ MnCl₂. Белок активен при комнатной температуре, при +42°C. Повышение ионной силы отрицательно влияет на биохимическую активность фермента. Добавление MtbDnaN вызывало умеренное повышение процессивности расщепления субстрата, при дальнейшем увеличении его концентрации активность MtbNucS ингибировалась. Была подтверждена ключевая роль аминокислотных замен W52S и D140A в функционировании активного центра MtbNucS. Были проведены эксперименты in vivo комплементации для снижения частоты мутаций у штаммов E. coli JM105 (mutL⁻, mutS⁻).

Obtained results and novelty (in Kazakh) : pET28c(+)/NucS, pMBP-parallel2/NucS және pET28c(+)/MtbDnaN векторлары алынды. E. coli Arctic Express (DE3)/pET28c(+)/MtbNucS және Arctic Express (DE3)/pMBP-parallel2/MtbNucS бактерияларында экспрессирленген NucS рекомбинантты белогы тазаланды. E. coli Arctic Express (DE3)/pMBP-parallel2/NucS бактериясында MBP-NucS гибридты белогы экспрессияланғаннан кейін TEV-протеаза қолданылып гибридты белок гидролизденді. Гель-фильтрация әдісімен гидролизденбеген белок пен протеаза қалдықтары алынып тасталды, ал алынған фракциялар негізінен жоғары гомогенділіктегі мақсатты белокты қамтыды. E. coli Arctic Express (DE3)/pET28c(+) бактериясынан MtbDnaN рекомбинантты белогы тазартылып алынды. MtbNucS белогы GT және UG қате жұптасқан негіздерді қамтитын ДНҚ-субстраттарға нуклеаздық белсенділігін көрсетеді. Каталитикалық белсенділік үшін оңтайлы жағдайлар: 25 мМ Tris-HCl pH 8,0; 5 мМ DTT; 0,1 мг/мл BSA; 0,1% Triton X-100; 40 мМ MgCl₂ және 2,25 мМ MnCl₂. Белок бөлме температурасында және +42°C-де белсенді. Иондық күштің жоғарылауы ферменттің биохимиялық белсенділігіне теріс әсер етеді. MtbDnaN қосылған кезде субстратты кесудің процессивтілігі орташа деңгейде артты, бірақ оның концентрациясы одан әрі жоғарылағанда MtbNucS белсенділігі төмендейді. MtbNucS белсенді орталығының қызметінде W52S және D140A аминқышқыл алмастыруларының негізгі рөлі расталды. Мутация жиілігін төмендету үшін E. coli JM105 (mutL⁻, mutS⁻) штамдарында in vivo комплементация эксперименттері жүргізілді.

The main constructive and technical economic indicators (in Russian) : Получены экспрессионные конструкции: pET28c(+)/MtbNucS, pMBP-parallel2/MtbNucS, pET28c(+)/MtbDnaN. Разработана схема экспрессии и очистки белков MtbNucS и MtbDnaN в системе E. coli Arctic Express (DE3). Получен высокогомогенный рекомбинантный фермент MtbNucS, проявляющий специфическую активность в отношении ошибочно спаренных оснований.

The main constructive and technical economic indicators (in Kazakh) : Экспрессиялық конструкциялар алынды: pET28c(+)/MtbNucS, pMBP-parallel2/MtbNucS, pET28c(+)/MtbDnaN. E. coli Arctic Express (DE3) жүйесінде MtbNucS және MtbDnaN ақуыздарын экспрессиялау мен тазарту сызбасы әзірленді. Қате жұптасқан негіздерге қатысты ерекше белсенділік көрсететін жоғары гомогенді рекомбинантты MtbNucS ферменті алынды.

Level of implementation (in Russian) : Полученные конструкции и протоколы экспрессии-очистки внедрены в практику лабораторных исследований молекулярной биологии ДНК-репарации. Разработанная система экспрессии может быть использована для дальнейших структурно-функциональных исследований ферментов репарации M. tuberculosis. Методика гидролиза гибридных белков с использованием TEV-протеазы и последующей гель-фильтрации применима для масштабируемого получения белка.

Level of implementation (in Kazakh) : Алынған конструкциялар мен экспрессия–тазарту протоколдары ДНҚ репарациясының молекулалық биологиясы саласындағы зертханалық тәжірибеге енгізілді. Әзірленген экспрессия жүйесі M. tuberculosis репарациялық ферменттерін құрылымдық-функционалдық зерттеулерде пайдалануға болады. TEV-протеаза қолданылған гибридті ақуыздарды гидролиздеу және кейінгі гель-фильтрация әдістемесі ақуызды ірі көлемде алу үшін бейімделген.

Efficiency (in Russian) : Получен фермент с высокой степенью чистоты. Подтверждена функциональная активность MtbNucS.

Efficiency (in Kazakh) : Жоғары тазалықтағы фермент алынды. MtbNucS ферментінің функционалдық белсенділігі расталды.

Field of application (in Russian) : Репарация ДНК

Field of application (in Kazakh) : ДНҚ репарация