The object of research, development or design (in Russian) : Объектом исследования являются генетические и молекулярные механизмы устойчивости чечевицы (Lens culinaris) к основным биотическим стрессам, включая поражение возбудителями аскохитоза (Ascochyta lentis) и фузариозного увядания (Fusarium oxysporum), а также целевые гены (SWEET4, CNGC и др.), участвующие во взаимодействии растения с патогенами.

The object of research, development or design (in Kazakh) : Зерттеу нысаны жасымық (Lens culinaris) негізгі биотикалық стресстерге төзімділігінің генетикалық және молекулалық механизмдері, соның ішінде аскохита (Ascochyta lentis) және фузариоз (Fusarium oxysporum) қоздырғыштарының зақымдануы, сондай-ақ өсімдіктердің патогендерімен әрекеттесетін мақсатты гендер (SWEET4, CNGC және т.б.) болып табылады.

Aim of work (in Russian) : Разработка технологии редактирования генома CRISPR/Cas для создания линий чечевицы, устойчивых к грибным патогенам, с использованием взаимодействия растительных патогенов и нокаутом генов, участвующих в этом взаимодействии.

Aim of work (in Kazakh) : Өсімдіктердің қоздырғыштарының өзара әрекеттесуін пайдалану және осы өзара әрекеттесулерге қатысатын гендерді жою арқылы саңырауқұлақ патогендеріне төзімді жасымық сызықтарын жасау үшін CRISPR/Cas геномын өңдеу технологиясын әзірлеу.

Методы исследования (на русском) : Для получения растений чечевицы с отредактированным геномом в данном исследовании были выбраны два ключевых гена: ортолог SWEET4 и ортолог CYCLIC NUCLEOTIDE-GATED ION CHANNEL (CNGC), для нокаута. Разработка протоспейсера (РНК с одинарным гидом) против этих генов проводилась следующим образом. Сначала последовательности целевых генов были получены из онлайн-инструмента Phytozome; использовался CDS-регион чечевицы CYCLIC NUCLEOTIDE-GATED ION CHANNEL (идентификатор гена: Lcu.2RBY.2g032450) и SWEET4 (идентификатор гена: Lcu.2RBY.2g058790). Затем с помощью онлайн-инструмента биоинформатики CHOPCHOP была разработана направленная РНК (г РНК) для области CDS каждого гена. Обе г РНК были разработаны с учётом высоких показателей эффективности попадания в цель и оптимального процента GC. Для облегчения клонирования в векторы, содержащие сайты BsaI, к прямому и обратному олигонуклеотидам были добавлены удлинители ATTG и AAAC соответственно. Информация о целевых генах: Название гена: SWEET4 ● Идентификатор гена: Lcu.2RBY.2g058790 ● Геном: Lens culinaris v1 ● Идентификатор транскрипта: Lcu.2RBY.2g058790.1 ● Расположение: Lcu.2RBY.Chr2:377461574..377474669 вперед ● Аннотация: PTHR10791:SF256 - ДВУНАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТЕР САХАРА SWEET4 ● CDS

Методы исследования (на казахском) : Осы зерттеуде геномы өңделген жасымық өсімдіктерін жасау үшін нокаутқа екі негізгі ген, SWEET4 ортологы және ЦИКЛІК нуклеотидтік қақпалы иондық арна (CNGC) ортологы таңдалды. Осы гендерге қарсы протоспакерді (бір бағыттаушы РНҚ) әзірлеу келесідей жүзеге асырылды. Біріншіден, мақсатты гендік тізбектер Phytozome онлайн құралынан алынды; жасымықтың ЦИКЛДЫҚ НУКЛЕОТИД-ҚАБЫЛДАҒЫ ИОН АРНАСЫНЫҢ CDS аймағы (ген идентификаторы: Lcu.2RBY.2g032450) және SWEET4 (ген идентификаторы: Lcu.2RBY.2g058790) пайдаланылды. Содан кейін әрбір геннің CDS аймағына арналған РНҚ (gRNA) мақсатты CHOPCHOP онлайн биоинформатика құралы арқылы әзірленді. Екі gRNA жоғары мақсатты тиімділікке және оңтайлы GC пайызына арналған. BsaI тораптары бар векторларға клондауды жеңілдету үшін ATTG және AAAC кеңейткіштері сәйкесінше тура және кері олигонуклеотидтерге қосылды. Мақсатты ген туралы ақпарат: Ген атауы: SWEET4 ● Ген идентификаторы: Lcu.2RBY.2g058790 ● Геном: Lens culinaris v1 ● Транскрипт идентификаторы: Lcu.2RBY.2g058790.1 ● Орналасқан жері: Lcu.2RBY.Chr2:377461574..377474669 алға ● Аннотация: PTHR10791:SF256 - ТӘТТІ4 ҚАНТ ТАСЫМАЛАТЫҒЫ ҚОСУ ● CDS

Obtained results and novelty (in Russian) : Научная новизна проекта, это то, что впервые применяется современная технология CRISPR/Cas9 для разработки образцов чечевицы с отредактированным геномом, которые будут устойчивыми к грибным болезням. Анализ CHOPCHOP привёл к отбору высокоэффективных последовательностей sgRNA для целевых генов SWEET4 и CNGC. Обе выбранные sgRNA имели высокую прогнозируемую эффективность попадания в целевую область и низкую прогнозируемую эффективность попадания вне целевой области в других участках генома Lens culinaris, что делает их идеальными кандидатами для эксперимента Сконструированные одно цепочечные прямые и обратные олигонуклеотиды sgRNA были успешно отожжены с образованием двухцепочечных ДНК-дуплексов, пригодных для клонирования. Результат отжига был подтвержден путем разделения продукта реакции в 2% агарозном геле, отожженный продукт проявился в виде отчетливой яркой полосы с ожидаемой низкой молекулярной массой (~24 п.н.), в то время как любые остаточные одно цепочечные олигонуклеотиды слились с геля или не были видны, что подтверждает успешное формирование дуплекса. После сборки этих дуплексов методом Golden Gate в вектор pKSE-401 реакционную смесь трансформировали в компетентные клетки E. coli TOP10 и высевали на селективные среды. Трансформация прошла успешно, в результате чего после ночной инкубации было получено множество хорошо очерченных отдельных колоний

Obtained results and novelty (in Kazakh) : Бұл жобаның ғылыми жаңалығы оның саңырауқұлақ ауруларына төзімді геномдық өңделген жасымық штамдарын жасау үшін заманауи CRISPR/Cas9 технологиясын бірінші рет қолдану болып табылады. Таңдалған өсімдіктер келесі ұрпақ беру үшін өздігінен ұрықтандырылады. CHOPCHOP талдауы SWEET4 және CNGC мақсатты гендер үшін жоғары тиімді sgRNA тізбегін таңдауға әкелді. SWEET4 үшін мақсатты тізбек негізгі экзонда орналасқан TCCACTTACCGTCATGGCAAAGG болды. Сол сияқты, CNGC үшін мақсатты реттілік ACATACTGGTCCGCTTCGTACGG болды. Таңдалған екі sgRNAs Lens culinaris геномының басқа аймақтарында жоғары болжамды мақсатты тиімділікке және төмен болжамды мақсаттан тыс тиімділікке ие болды, бұл оларды эксперимент үшін тамаша үміткерлер етті. Жасалған бір тізбекті алға және кері sgRNA олигонуклеотидтері клондау үшін қолайлы қос тізбекті ДНҚ дуплекстерін қалыптастыру үшін сәтті жасытылған. Жасыту нәтижесі реакция өнімін 2% агарозды гельде бөлу арқылы расталды. Жасытылған өнім күтілетін төмен молекулалық массасы (~24 бит) бар айқын, жарқын жолақ ретінде пайда болды, бұл ретте кез келген қалдық бір тізбекті олигонуклеотидтер гельден біріктірілді немесе көрінбеді, бұл сәтті дуплексті түзуді растайды. Осы дуплекстерді Golden Gate әдісі арқылы pKSE-401 векторына құрастырғаннан кейін реакция қоспасы E. coli TOP10 сауатты жасушаларына айналдырылды және селективті ортада қапталды. Трансформация сәтті болды, нәтижесінде түнгі инкубациядан кейін көптеген жақсы анықталған жеке колониялар пайда болды.

The main constructive and technical economic indicators (in Russian) : В ходе работы проведён анализ с использованием CHOPCHOP, позволивший отобрать высокоэффективные sgRNA для генов SWEET4 (TCCACTTACCGTCATGGCAAAGG) и CNGC (ACATACTGGTCCGCTTCGTACGG), отличающихся высокой специфичностью и низким риском внецелевых эффектов. Полученные двухцепочечные ДНК-дуплексы sgRNA были успешно синтезированы и подтверждены методом электрофореза в 2% агарозном геле, после чего встроены в вектор pKSE-401 методом Golden Gate. Конструкции были трансформированы в клетки E. coli TOP10, где обеспечили рост множества отдельных колоний, что подтверждает эффективность сборки. Процесс включает использование стандартного молекулярно-биологического оборудования (термоциклер, электрофорез, ламинар, инкубатор) и реактивов для клонирования, Полученные рекомбинантные плазмиды служат основой для дальнейшей трансформации в Agrobacterium tumefaciens и редактирования генов устойчивости чечевицы к патогенам.

The main constructive and technical economic indicators (in Kazakh) : Зерттеу барысында SWEET4 (TCCACTTACCGTCATGGCAAAGG) және CNGC (ACATACTGGTCCGCTTCGTACGG) гендері үшін жоғары тиімді sgRNA-ларды таңдауға мүмкіндік беретін CHOPCHOP талдауы орындалды, жоғары ерекшелікпен және мақсаттан тыс әсер ету қаупі төмен. Алынған қос тізбекті ДНҚ sgRNA дуплекстері сәтті синтезделді және 2% агарозды гельде электрофорез арқылы расталды, содан кейін олар Golden Gate әдісі арқылы pKSE-401 векторына енгізілді. Құрылымдар E. coli TOP10 жасушаларына айналдырылды, оларда бірнеше жеке колониялар өсті, бұл жинақтың тиімділігін растады. Процесс стандартты молекулярлық биология жабдықтарын (термоциклерлік, электрофорез, ламинарлы қалпақ, инкубатор) және клондау реагенттерін қолдануды қамтиды. Алынған рекомбинантты плазмидтер Agrobacterium tumefaciens-ке әрі қарай трансформациялану және жасымықтың патогендерге төзімділік гендерін редакциялау үшін негіз болады.

Level of implementation (in Russian) : Разработанные рекомбинантные конструкции на основе вектора pKSE-401, содержащие высоко специфичные sgRNA для генов SWEET4 и CNGC, могут быть внедрены в практику агробиотехнологических лабораторий и селекционных центров, занимающихся созданием устойчивых к патогенам линий чечевицы. Технология позволяет эффективно использовать систему CRISPR/Cas9 для направленного редактирования генов, ответственных за восприимчивость растений к аскохитозу и фузариозному увяданию

Level of implementation (in Kazakh) : SWEET4 және CNGC гендері үшін жоғары спецификалық sgRNA бар pKSE-401 векторы негізінде әзірленген рекомбинантты құрылымдарды агробиотехнологиялық зертханаларда және патогенге төзімді жасымық линияларын жасайтын селекциялық орталықтарда енгізуге болады. Технология CRISPR/Cas9 жүйесін өсімдіктің аскохита жапырақ дақтары мен фузариоздың солуына бейімділігіне жауапты гендерді мақсатты редакциялау үшін тиімді пайдалануға мүмкіндік береді.

Efficiency (in Russian) : Ожидаемая эффективность выражается в: • в повышении точности геномных модификаций до 90–95%, • в сокращении сроков выведения устойчивых форм чечевицы на 30–40% по сравнению с традиционными методами, • снижении затрат на селекционные испытания и фитопатологический скрининг на 25–30%, • возможности масштабирования технологии для других зернобобовых культур.

Efficiency (in Kazakh) : Іске асырудың күтілетін тиімділігі мынада көрсетіледі: • геномдық модификациялардың дәлдігін 90–95%-ға дейін арттыру, • дәстүрлі әдістермен салыстырғанда жасымықтың төзімді сорттарын әзірлеуге кететін уақытты 30-40%-ға қысқарту; • асыл тұқымды сынақтар мен фитопатологиялық скрининг шығындарын 25-30%-ға қысқарту; • басқа бұршақ дақылдары үшін технологияны кеңейту әлеуеті.

Field of application (in Russian) : Применимость полученных результатов будет обеспечена и внедрена лучшие сорта и линии зернобобовых культур и обеспечит коммерциализуемость результатов.

Field of application (in Kazakh) : Алынған нәтижелердің қолдану мүмкіндігі қамтамасыз етіліп, нәтижелерді коммерцияландыруды қамтамасыз ете отырып, бұршақ тұқымдас дақылдардың ең жақсы сорттары мен линиялары енгізілетін болады.