The object of research, development or design (in Russian) : Грибковые фитопатогены, сельскохозяйственные культуры, CRISPR/Cas12a.

The object of research, development or design (in Kazakh) : Саңырауқұлақ фитопатогендері, ауылшаруашылық дақылдар, CRISPR/Cas12a.

Aim of work (in Russian) : Целью Проекта является разработка технологии обнаружения фитопатогенов сельскохозяйственных культур на основе современного метода диагностики, основанного на использовании ранее неизученных Cas эффекторов Cas12a CRISPR/Cas систем. Полученные результаты расширят спектр используемых эндонуклеаз, позволяющих проводить детекцию фитопатогенов в полевых условиях, не требующих дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного персонала и специализированных помещений.

Aim of work (in Kazakh) : Жобаның мақсаты бұрын зерттелмеген Cas эффекторларының Cas12a CRISPR/Cas жүйелерін қолдана отырып заманауи диагностикалық әдіс негізінде ауыл шаруашылығы дақылдардың ауру патогендерін табылатын технологиясын жасау болып табылады. Алынған нәтижелер қымбат құрал-жабдықтарды, жоғары білікті мамандарды және мамандандырылған қондырғыларды қажет етпейтін егін жағдайында қолданылатын фитопатогендерді табыла алатын эндонуклеазалардың спектрі кеңейтіледі.

Методы исследования (на русском) : Методы микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и биохимии.

Методы исследования (на казахском) : Микробиология, молекулалық биология, генетикалық инженерия және биохимия әдістері.

Obtained results and novelty (in Russian) : Были выбраны и амплифицированы генетические локусы для идентификации грибковых фитопатогенов зерновых культур. Амплификация целевых последовательностей была проведена методом ПЦР. Результаты ПЦР были проанализированы методом горизонтального электрофореза и визуализированы при помощи GelDoc Go Imaging System (BioRad). Полученные ампликоны были клонированы в промежуточный вектор PJem1.2 (CloneJET PCR cloning Kit, ThermoScientific). Скрининг на наличие клонированных ампликонов был произведен используя 10 единичных колоний после ночной инкубации методом ПЦР и горизонтального электрофореза. Очистка рекомбинантных плазмид из успешно трансформированных клонов была осуществлена с помощью набора CloneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Полученные рекомбинантные вектора были просеквенированы методом Сэнгера. На основе результатов анализа секвенирования были подобраны специфичные праймеры для изотермической амплификации и были отобраны локусы используя протоспейсер РАМ - TTTN. Были проведены дизайн и синтез crРНК с помощью in vitro транскрипции с использованием Т7 РНК полимеразы для образования комплекса с ДНК-субстратом видоспецифичных локусов в качестве мишени обнаружения. Были оптимизированы условия изотермической реакции (RPA, Recombinase Polymerase Amplification) для амплификации локусов: прямой и обратный праймеры, Primer-Free Rehydration буфер, DEPC-вода, MgOAc, ДНК. Длительность реакции составляла 20 минут при 39 °С, каждые 4 минуты образцы вортексировались.

Obtained results and novelty (in Kazakh) : Дәнді дақылдардың саңырауқұлақ фитопатогендерін анықтау үшін қолданылатын генетикалық локустар таңдалды және амплификацияланды. Мақсатты тізбектердің амплификациясы ПТР әдісімен өткізілді. ПТР нәтижелері горизонталды электрофорез әдісімен талдалды және GelDoc Go Imaging System (BioRad) арқылы визуалды түрде көрсетілді. Алынған ампликондар PJem1.2 (CloneJET PCR cloning Kit, ThermoScientific) аралық векторына клондалды. Түнгі инкубациядан кейін 10 бірлік колониялардың негізінде ПТР мен горизонталды электрофорез әдісімен клондалған ампликондардың бар екеніне скрининг жасалды. CloneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) жинағы арқылы сәтті трансформацияланған клондардан рекомбинанты плазмидалар тазартылды. Алынған рекомбинантты векторлар Сэнгер әдісімен реттелген. Сиквенс талдау нәтижелерінің негізінде изотермиялық амплификация үшін спецификалық праймерлер таңдалды және протоспейсер РАМ – TTTN бойынша локустар алынды. Анықтау нысанасы ретінде түрге спецификалық локустардың ДНҚ субстраты бар кешен құру үшін T7 РНҚ-полимеразаны пайдалана отырып in vitro транскрипциясы арқылы crRNA құрастырылды (дизайн) және синтезделді. Локустарды амплификациялану үшін изотермиялық реакцияның (RPA, Recombinase Polymerase Amplification) шарттары оңтайландырылды: тікелей және кері праймерлер, Primer-Free Rehydration буфер, DEPC-су, MgOAc, ДНҚ. Реакцияның ұзақтығы 39 °С-да 20 минут құрады, әр 4 минут сайын үлгілер құйынды (вортекс).

The main constructive and technical economic indicators (in Russian) : Клонированы генетические локусы в промежуточные вектора для идентификации патогенов зерновых культур. Подобраны специфичные праймеры для RPA. Проведены дизайн и синтез crРНК с помощью in vitro транскрипции с использованием Т7 РНК полимеразы.

The main constructive and technical economic indicators (in Kazakh) : Дәнді дақылдардың патогендерін анықтау үшін генетикалық локустар аралық векторларға клондалды. RPA үшін арнайы праймерлер таңдалды. T7 РНҚ-полимеразаны пайдалана отырып in vitro транскрипциясы арқылы crRNA құрастырылды (дизайн) және синтезделді.

Level of implementation (in Russian) : Не внедрено.

Level of implementation (in Kazakh) : Жүзеге асырылмады.

Efficiency (in Russian) : Отобранные генетические локусы позволят идентифицировать патогены зерновых культур. Специфичные праймеры для RPA позволят проводить изотермические реакции. Дизайн и синтез crРНК с помощью in vitro транскрипции с использованием Т7 РНК полимеразы позволят образовывать комплекс с ДНК-субстратом.

Efficiency (in Kazakh) : Таңдалған генетикалық локустар дәнді дақылдардың патогендерін анықтауға мүмкіндік береді. RPA үшін арнайы праймерлер изотермиялық реакцияларды өткізуге мүмкіндік береді. T7 РНҚ-полимеразаны пайдалана отырып in vitro транскрипциясы арқылы құрастырылған және синтезделген crRNA ДНҚ-субстратын құруға мүмкіндік береді.

Field of application (in Russian) : Сельское хозяйство.

Field of application (in Kazakh) : Ауыл шаруашылығы.